【產(chǎn)品名稱】新型冠狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒

【包裝規(guī)格】50T/盒

【使用范圍】該試劑盒用于使用咽拭子，鼻咽拭子，肺泡灌洗液，痰液樣品定性檢測(cè)新型冠狀病毒（2019-nCoV）。該試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)病情進(jìn)行全面分析。

【測(cè)試原理】該試劑盒基于一步式RT-PCR技術(shù)。選擇2019年新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因作為擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域。設(shè)計(jì)了特異性引物和熒光探針（N基因探針用FAM標(biāo)記，ORF1ab探針用HEX標(biāo)記），用于檢測(cè)樣品中的2019年新型冠狀病毒RNA。該試劑盒還包括一個(gè)內(nèi)源性內(nèi)部控制檢測(cè)系統(tǒng)（內(nèi)部控制基因探針標(biāo)記有CY5），用于監(jiān)測(cè)樣本收集，RNA和PCR擴(kuò)增的過程，從而減少假陰性結(jié)果。

【主要成分】

自備試劑：RNA提取或純化試劑。

陰性/陽性對(duì)照：陽性對(duì)照是包含靶標(biāo)片段的RNA，陰性對(duì)照是無核酸水。在使用過程中，它們應(yīng)參與提取，并應(yīng)被視為傳染性物質(zhì)。它們應(yīng)按照有關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理和處置。

內(nèi)參基因?yàn)槿?/span>RnaseP基因。

【保存條件和有效期】-20±5℃，有效期6個(gè)月，反復(fù)凍融次數(shù)不應(yīng)超過5次。

【適用儀器】擁有FAM/HEX/CY5等多通道熒光PCR儀。

【標(biāo)本要求】

1.適用的樣本類型：鼻/咽拭子、痰、肺泡灌洗液。

2.標(biāo)本采集（無菌技術(shù)）

咽拭子：同時(shí)用兩根拭子擦拭扁桃體和咽后壁，然后將拭子頭浸入裝有采樣液的試管中；

痰：患者深咳后，將咳嗽的痰收集在裝有采樣液的螺帽試管中；

肺泡灌洗液：由專業(yè)的醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行采集。

3.樣品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸

用于病毒分離和RNA檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行測(cè)試。24小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)到的標(biāo)本可在4℃下保存；那些在24小時(shí)內(nèi)無法檢測(cè)到的物品應(yīng)存放在-70℃或以下（如果沒有-70℃的存放條件，則應(yīng)暫時(shí)存放在-20℃冰箱中）。標(biāo)本應(yīng)避免在運(yùn)輸過程中反復(fù)凍結(jié)和解凍。標(biāo)本應(yīng)在收集后盡快送到實(shí)驗(yàn)室。如果樣品需要長(zhǎng)距離運(yùn)輸，建議使用干冰進(jìn)行存儲(chǔ)。

【測(cè)試方法】

1  樣本處理和RNA提取（樣本處理區(qū)）

建議取200μl液體樣品進(jìn)行RNA提取，相關(guān)提取步驟參照商品化RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。該試劑盒中的陰性和陰性對(duì)照均參與提取。

2  PCR試劑制備（試劑制備區(qū)）

2.1  從試劑盒中取出所有組份在室溫解凍后，搖動(dòng)并混合。使用前以8,000 rpm離心幾秒鐘；計(jì)算試劑所需量，反應(yīng)體系配制見下表：

2.2  徹底混合各組分后，短時(shí)間離心以使管壁上的所有液體落到管底部，然后將20 μl擴(kuò)增系統(tǒng)等分到PCR管中

3  采樣（標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)）

分別添加5μl提取后陰、陽性對(duì)照，待測(cè)標(biāo)本的RNA到PCR反應(yīng)管中，蓋緊管，并在8,000 rpm離心數(shù)秒后，將其轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)域。

4  PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)）

4.1將反應(yīng)管放入儀器的樣品池中，參數(shù)設(shè)定如下：

5  結(jié)果分析（請(qǐng)參考各儀器的使用說明書進(jìn)行設(shè)置）

反應(yīng)后，保存結(jié)果。分析后根據(jù)圖像調(diào)整基準(zhǔn)線的起始值，終止值和閾值（用戶可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，起始值可以設(shè)置為3?15，終止值可以設(shè)置為5?20，調(diào)整）在對(duì)數(shù)圖窗口的閾值處，使閾值線處于對(duì)數(shù)階段，陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線為直線或低于閾值線）。

6  質(zhì)量控制

陰性對(duì)照：FAM、HEX、CY5檢測(cè)通道沒有明顯的擴(kuò)增曲線;

nCOV陽性對(duì)照：FAM和HEX檢測(cè)通道的明顯擴(kuò)增曲線，Ct值≤32；

在同一實(shí)驗(yàn)中必須同時(shí)滿足以上要求；否則，該實(shí)驗(yàn)無效，需要再次進(jìn)行。

7  結(jié)果的確定

7.1  若測(cè)試樣品的FAM和HEX通道中沒有擴(kuò)增曲線或Ct值> 40，CY5通道中存在擴(kuò)增曲線，則可以判斷樣品中沒有新型冠狀病毒（2019-nCoV）RNA；

7.2   若測(cè)試樣品為人真實(shí)樣本且FAM、HEX和CY5通道中均沒有擴(kuò)增曲線或Ct值> 40，則可以判斷此次實(shí)驗(yàn)無效，需重新測(cè)試；

7.3   若測(cè)試樣品在FAM和HEX通道中具有明顯的擴(kuò)增曲線，且Ct值≤40，則可以判斷該樣品對(duì)新型冠狀病毒（2019-nCoV）呈陽性。

7.4  若測(cè)試樣品僅在FAM或HEX的一個(gè)通道中具有明顯的擴(kuò)增曲線，且Ct值≤40，而另一個(gè)通道中沒有擴(kuò)增曲線，則需要重新測(cè)試結(jié)果。如果重新測(cè)試結(jié)果一致，則可以判斷該樣品對(duì)新型冠狀病毒（2019-nCoV）呈陽性。如果重新測(cè)試結(jié)果是否定的，則可以判斷該樣品對(duì)新型冠狀病毒（2019-nCoV）呈陰性。

【測(cè)試結(jié)果的解釋】

1.每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)測(cè)試陰性和陽性對(duì)照。只有當(dāng)對(duì)照滿足質(zhì)量控制要求時(shí)，才能確定測(cè)試結(jié)果

2.當(dāng)FAM和HEX檢測(cè)通道為正時(shí)，由于系統(tǒng)競(jìng)爭(zhēng)，來自CY5通道（內(nèi)部控制通道）的結(jié)果可能為負(fù)。

3.當(dāng)內(nèi)部控制結(jié)果為負(fù)時(shí)，如果試管的FAM和HEX檢測(cè)通道也為負(fù)，則表明系統(tǒng)被禁止或操作錯(cuò)誤，則測(cè)試無效。因此，樣品需要重新測(cè)試。

【測(cè)試方法的局限性】

1.樣品測(cè)試結(jié)果與樣品采集，處理，運(yùn)輸和存儲(chǔ)的質(zhì)量有關(guān)。不合理的樣品采集，轉(zhuǎn)移，存儲(chǔ)和處理可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的測(cè)試結(jié)果。

2.樣品處理過程中交叉污染控制不佳，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3.在流行期間，病毒的基因突變也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

4.此試劑盒的測(cè)試結(jié)果僅供臨床參考。應(yīng)結(jié)合患者的癥狀/體征，病史，其他實(shí)驗(yàn)室檢查和治療反應(yīng)來考慮患者的臨床診斷和治療。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

產(chǎn)品分析性能評(píng)估結(jié)果：

1  該試劑盒的分析靈敏度為103拷貝/ ml。

2.交叉反應(yīng)：不與其他病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，例如地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、人類基因組DNA與2019年新型冠狀病毒相似或引起類似癥狀。

3.外源性干擾物質(zhì)：標(biāo)本中針對(duì)患者可能使用的治療藥物，如粘蛋白，苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）、倍氯美松、地塞米松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、阿奇霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、妥布霉素均不會(huì)干擾試劑盒的測(cè)試結(jié)果。

4.痰和咽拭子標(biāo)本中可能存在的內(nèi)源性物質(zhì)，例如全血和粘液，不會(huì)影響試劑盒的測(cè)試結(jié)果。

5.精度：批內(nèi)/批間精度，日內(nèi)/日常精度，不同操作者之間的精度變異系數(shù)（CV）不大于5％。

6.陰性/陽性參照物的符合率：3種陽性參照物和10種陰性參照物的符合率均為100％。

7.將臨床評(píng)價(jià)結(jié)果與通過新型冠狀病毒感染的肺炎患者診治方案和通過新型冠狀病毒感染的肺炎患者監(jiān)測(cè)方案（第二版）中通過推薦方法獲得的確認(rèn)/排除結(jié)果進(jìn)行比較。分析了解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院，廣東省疾病預(yù)防控制中心等8家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的實(shí)際使用情況。通過初步分析，基本確定了該產(chǎn)品的臨床性能可以滿足流行情況的緊急需求。用于臨床評(píng)估的樣品類型包括咽拭子和痰液。產(chǎn)品上市后將收集更多臨床數(shù)據(jù)，以確認(rèn)其臨床性能。

【注意事項(xiàng)】

1  本產(chǎn)品僅用于體外測(cè)試。實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明。

2  為了避免樣本中任何潛在的生物危害，應(yīng)將樣本視為具有傳染性，并避免與人體皮膚和粘膜接觸；標(biāo)本應(yīng)在生物安全柜中處理，以防止氣溶膠流出。樣品制備區(qū)域中使用的試管和尖端應(yīng)倒入盛有消毒劑的容器中，并與醫(yī)療廢物一起消毒后再丟棄。樣品處理和加工必須符合當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)規(guī)定。

3  產(chǎn)品加工：PCR后，該產(chǎn)品很可能造成污染。所有的反應(yīng)管應(yīng)由當(dāng)天不再參與實(shí)驗(yàn)的人員放入生物安全垃圾處理袋或其他容器中，然后在完全密封后丟棄。

4  在整個(gè)過程中避免RNase污染。實(shí)驗(yàn)期間，請(qǐng)穿著工作服，一次性手套和口罩。在通風(fēng)良好的化學(xué)通風(fēng)櫥或生物安全柜中完成操作，該柜要用紫外線清潔，消毒和滅菌，以防止任何有害物質(zhì)進(jìn)入呼吸道。

5  使用高壓滅菌的一次性離心管和吸頭，或購買無DNase和RNase的離心管和吸頭。

6  使用前要完全解凍PCR檢測(cè)試劑，并在8000 rpm離心幾秒鐘后使用，但要避免反復(fù)凍融。

7  如果在樣品處理過程中不能很好地控制交叉污染，則可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

8  實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室人員必須接受專業(yè)培訓(xùn)。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)嚴(yán)格劃分為不同區(qū)域（試劑制備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增試驗(yàn)區(qū)）。所有消耗品均應(yīng)消毒一次使用。實(shí)驗(yàn)的每個(gè)階段均應(yīng)使用專用儀器和設(shè)備。每個(gè)階段的每個(gè)區(qū)域的用品都不得交叉使用。

9  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)使用10％的次氯酸鹽或75％的酒精對(duì)工作臺(tái)和移液器進(jìn)行消毒，然后將其置于紫外線下20-30分鐘。

10   RNA樣品提取完成后，建議立即進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)。否則，請(qǐng)將提取物儲(chǔ)存在-20℃以便使用（24小時(shí)內(nèi)）；

11  必須對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。

12  各種因素可能會(huì)導(dǎo)致試劑在存儲(chǔ)，運(yùn)輸和使用過程中性能發(fā)生變化，例如不正確的存儲(chǔ)和運(yùn)輸，非標(biāo)準(zhǔn)樣品采集，樣品處理和測(cè)試。請(qǐng)嚴(yán)格遵守說明。由于樣品采集過程的特征（例如，用棉簽采樣和病毒感染過程本身），可能由于采集的樣品不足而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)結(jié)合其他臨床診斷和治療信息對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行重新檢測(cè)。