【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：貓皰疹病毒I型檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）

英文名稱：Feline Herpesvirus I Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

貓皰疹病毒I型?。?/span>Feline Herpesvirus I,FHV-1）,又叫貓鼻氣管炎病毒是由貓皰疹病毒I型（FHV-1）引起的貓呼吸道感染等疾病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，主要用于貓皰疹病毒I型的定性篩查檢測(cè)及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)貓皰疹病毒I型基因設(shè)計(jì)特異性引物和分子信標(biāo)探針，在待檢樣本中含有貓皰疹病毒I型DNA的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為不含貓皰疹病毒I型的其它菌的混合物，陽(yáng)性對(duì)照為滅活的貓皰疹病毒I型。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 采集貓的咽喉拭子、眼睛、鼻分泌物或潰瘍傷口等作為樣本，咽喉拭子用少量生理鹽水浸潤(rùn)后取上清待檢；其他樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000 g離心15 min，收集上清待檢

2. 如需在增菌后進(jìn)行PCR檢測(cè)，則應(yīng)使用選擇性增菌液對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行增菌。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

a.計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)，從-20℃以下冰箱保存的試劑盒中取等量8聯(lián)PCR反應(yīng)管（內(nèi)裝有PCR反應(yīng)液及混合酶液）,平衡至室溫；預(yù)留一管作為陰性對(duì)照一管作為陽(yáng)性對(duì)照。

b.將實(shí)驗(yàn)所需的8聯(lián)PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書操作?；虬匆韵路椒ú僮鳎?/span>

a.取試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞過(guò)來(lái)的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。

b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無(wú)菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。

c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。

d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測(cè)。

3.加樣

a.取出8聯(lián)PCR反應(yīng)管試劑，瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

b.打開(kāi)反應(yīng)管管蓋，在液封層上（切勿插入底部）加入5 μL處理好的樣本重懸液；陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品；

c.蓋好PCR反應(yīng)管蓋，瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

d.記錄模板加樣順序。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行PCR檢測(cè)。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用，對(duì)于本試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。

3. 為保證試劑不受標(biāo)本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。